GV3101 感受態(tài)細(xì)胞介紹：

C58(rifR)TipMP90(pTiC58DT-DNA)(gentR)Nopaline  

GV3101 感受態(tài)細(xì)胞產(chǎn)品說明：  

GV3101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pMP90(pTiC58DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pMP90(pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。pMP90(pTiC58DT-DNA)型Ti質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：gent，賦予GV3101菌株慶大霉素抗性，適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作，本公司生產(chǎn)的GV3101化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pCAMBIA2301質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>104cfu/μgDNA。  

操作方法：  

1.取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中。  

2.每100μl感受態(tài)加入0.01-1μg質(zhì)粒DNA（轉(zhuǎn)化效率較高，次使用前做預(yù)實(shí)驗確定所加質(zhì)粒的量），用手管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。  

3.加入700μl無抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。  

4.6000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天。  

（當(dāng)平板只含有50μg/mlkan時，28℃培養(yǎng)48h即可；平板中同時加入50μg/mlkan，20μg/mlrif時，需28℃培養(yǎng)60h；如果使用的平板含有50μg/mlrif則需要28℃培養(yǎng)72-90h）。  

注意事項：

1.加入質(zhì)粒時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。  

2.混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少終用于涂板的菌量。  

3.平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。  

4.利福平濃度不應(yīng)高于25μg/ml，過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司感受態(tài)計算轉(zhuǎn)化效率時所用平板只含有50μg/mlkan，若所用平板含有20μg/mlrif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。  

5.培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮這些抗生素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。  

備注：  

1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方：

2、常用農(nóng)桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

3、LB及YEB配方：

10種農(nóng)桿菌化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)產(chǎn)品僅需冰、液氮和37℃ 熱激操作即可，實(shí)驗簡單方便，經(jīng)pCAMBIA2301 (11.6 Kb)質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×104 cfu/μg。同時提供7種農(nóng)桿菌電擊感受態(tài)產(chǎn)品，可成功轉(zhuǎn)化大于50 Kb的載體，經(jīng)pCAMBIA2301 (11.6 Kb)質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×105 cfu/μg。