試劑、試

劑盒

轉(zhuǎn)錄緩沖液DTT RNA酶抑制劑CTP ATP S-UTP乙酸銨乙醇

儀器、耗

材

水溶鍋、離心機(jī)、培養(yǎng)箱、烘箱

實(shí)驗(yàn)步驟

1.在一個(gè)含SP6. T3或T7啟動(dòng)子的載體中，插入目的基因。在編碼序列下游酶切使質(zhì)粒呈線

性。DNAL以酚/氨0仿抽提， 乙醇沉淀，70%乙醇洗后晾干。以無菌水重溶沉淀至1 ug/ul。

2.室溫配置如下反應(yīng)混合液(總體積20μl) :

(1) 4.0 ul 5x轉(zhuǎn)錄緩)沖液

(2) 0.2 ul 1 mol/ DTT

(3) 60 U RNA酶抑制劑

(4) 1.0 ul三種10 mmol/l NTP中的每-種

(5) 1.0 ul 1 ug/ul酶切DNA

(6) 10.0μ ζ[35s] UTP

(7) 16 U SP6或T7 RNA聚合酶

(8) 37*C溫育30 min,再加16 U聚合酶并于37 °C溫育40 min。

3.在反應(yīng)混合液中加入: 60 U RNA酶抑制劑，20 μl 10 mg/ml的載體RNA和1.0μl酶1,于37°C溫育10 min以除去摸板。

4.往反應(yīng)混合液加入以下液體: 0.8 ul 1 mol/l DTT. 63 μul 無菌水和10 μI3 mol/l乙酸鈉，取出1 ul測定其cpm/ul值。

5.加36.4μ7.5 molM的乙酸銨于反應(yīng)混合液(終濃度2 mol/)加50~100 ug tRNA載體和272ul冷無水乙醇，置干冰上沉淀10 min,以冷70%乙醇洗沉淀，晾干，需要的話可重復(fù)此步。以100μl 10 mmol/l DTT重溶DNA沉淀。

6.確定其cpm/μl值， 并計(jì)算摻入百分比，核糖核酸探針應(yīng)于2~3天內(nèi)使用。

(70%到90%的標(biāo)記摻入，結(jié)果可得70~90 ng標(biāo)記的RNA)