基因敲除原理 我們是利用CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)，CRISPR是一種來源于細菌免疫系統(tǒng)的基因編輯技術，能精確識別靶細胞DNA片段中靶點的核苷酸序列，利用核酸內(nèi)切酶蛋白對DNA靶點序列進行切割，產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂，斷裂將在體內(nèi)被細胞修復機制修復，其中，非同源末端連接NHEJ這種修復將產(chǎn)生短的核酸插入或刪除，其帶來的基因移碼突變，將導致提前出現(xiàn)終止密碼子，從而完成對靶細胞DNA目的基因片段的敲除。在PAM片段上游設計sgRNA后，通過構建基因敲除載體，結(jié)合慢病毒系統(tǒng)，可以實現(xiàn)外源基因的整合，利用抗生素或熒光，最終篩選出成功實現(xiàn)基因敲除的細胞。 CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)服務優(yōu)勢： （1）廣泛適用于哺乳動物細胞，脫靶率更低 （2）提高轉(zhuǎn)染率，減低細胞毒性，縮短實驗周期 基因敲除細胞株的項目流程： （1）項目評估（免費） （2）細胞抗生素敏感濃度摸索與單克隆形成驗證 （3）sgRNA設計與敲除載體構建 （4）慢病毒包裝與轉(zhuǎn)染 （5）陽性多克隆篩選 （6）陽性單克隆篩選 （7）敲除驗證 基因敲除服務周期：根據(jù)細胞生長特性與基因不同，服務周期在5～10周不等。 服務流程：                      客戶提供：靶細胞及其培養(yǎng)方案、基因名稱 交付標準：1×基因敲除陽性單克隆細胞株（復蘇）                   1×項目結(jié)題報告 服務保證： （1）項目啟動后，密切跟進實驗進展，每兩周進行一次項目進度匯報。 （2）項目結(jié)題報告包含sgRNA序列、實驗詳細記錄、測序結(jié)果及分析等，滿足客戶后期論證材料需求。 （3）基因敲除陽性單克隆均經(jīng)過靶標片段T載體克隆測序驗證，保證基因敲除。 【案例分享】CRISPR/Cas9基因敲除細胞株構建 1 抗生素敏感濃度摸索?? 將細胞如下圖1稀釋。給藥7天后，棄培養(yǎng)液，用臺盼藍染色2 min，顯微鏡下觀察細胞存活情況。確定細胞多克隆細胞篩選和單克隆細胞篩選濃度。                                       圖1 抗性濃度摸索 2 單克隆形成驗證 細胞計數(shù)，將細胞懸液稀釋混勻后加入96孔板，用封口膠將孔板封好，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)48 h后每日觀察并記錄單克隆形成情況。 3 靶標基因sgRNA 設計 根據(jù)基因序列信息，設計 sgRNA。 4 位點序列信息確認 PCR擴增（圖2），測序驗證基因序列，以確定sgRNA區(qū)域有無SNP。                                 圖2 靶標序列擴增 5 敲除載體構建 退火，連接，轉(zhuǎn)化，涂板（LB/Amp）培養(yǎng)。 每個實驗組各挑取6個單克隆菌落，于LB/ Amp培養(yǎng)基中擴增，提取質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒提取效果（圖3）。                                             圖3 質(zhì)粒抽提 酶切驗證 ：取3個單克隆酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果（圖4）。選擇2個樣品送樣測序。                                圖4 單克隆酶切驗證 6 慢病毒包裝 敲除載體無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取，病毒包裝。 7 細胞轉(zhuǎn)染 配制梯度病毒稀釋液，細胞于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h。 8 陽性多克隆細胞株篩選 9 陽性單克隆細胞株篩選 細胞轉(zhuǎn)染48h后，更換培養(yǎng)基，篩選至對照組大部分細胞死亡，實驗組細胞擴大培養(yǎng)，進行單克隆篩選。幾天后挑選陽性單克隆進行擴增，并取樣驗證。  10 陽性單克隆細胞株驗證 1、測序驗證 提取陽性單克隆細胞株的基因組，將靶標基因酶切克隆至T載體后測序，以確定是否敲除成功。 實驗結(jié)果示例： 該基因有兩個單克隆細胞株，A1和A2。 單克隆細胞A1的目的基因在sgRNA2位置出現(xiàn)兩種突變形式，分別缺失1個和19個堿基，在新序列的第337位和第355位堿基提前出現(xiàn)終止密碼子。 單克隆細胞A2的目的基因在sgRNA2位置發(fā)生突變，插入1個堿基，在新序列的第340位堿基提前出現(xiàn)終止密碼子。
產(chǎn)品規(guī)格：T25培養(yǎng)瓶/凍存管 細胞數(shù)量1x10^6
運輸方式：常溫運輸/干冰運輸 用途限制：僅供科研
細胞接收后處理： 收到細胞后，及時核對培養(yǎng)瓶/凍存管上標注的細胞名稱是否正確，以及培養(yǎng)瓶是否有破損或漏液等異常情況。如發(fā)現(xiàn)問題請及時與銷售聯(lián)系。 收到常溫運輸?shù)募毎囵B(yǎng)瓶后，請在顯微鏡下仔細觀察細胞生長狀態(tài)，并拍照留證（為細胞售后提供依據(jù)）。將培養(yǎng)瓶放置于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待細胞融合度為70%~80%狀態(tài)再進行細胞處理。（注：運輸過程易導致部分細胞脫落，漂浮，屬正?，F(xiàn)象，放置培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，可使其貼壁；另。請使用新鮮培養(yǎng)基和新的T53培養(yǎng)瓶進行細胞傳代，不要使用原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基。 收到凍存細胞應立即復蘇或放置液氮罐中。 收到復蘇好后的細胞一周內(nèi)，如若發(fā)現(xiàn)細胞狀態(tài)不佳或細胞污染，請及時與銷售聯(lián)系，并提供該細胞詳細的實驗操作說明和每天細胞狀態(tài)的圖片記錄（填寫【細胞售后反饋表】），經(jīng)由我司技術人員核實，若確認細胞本身存在問題，由我司重新復蘇細胞并補發(fā)。

公司簡介

廣州艾迪基因科技有限責任公司由多名留學歸國博士和生物科技領域精英聯(lián)合創(chuàng)建，坐落于廣州產(chǎn)業(yè)示范基地——科學城。作為基因編輯/細胞單克隆專家，公司專注于發(fā)展和優(yōu)化基于CRISPR/Cas的基因組編輯技術，依托*單克隆打印平臺，為用戶提供高質(zhì)量的技術服務和基因編輯產(chǎn)品。
        我們堅守“以客戶為中心、以奮斗者為本”的原則，秉承“創(chuàng)新、共享”的發(fā)展理念，以達到客戶對“產(chǎn)品質(zhì)量的滿意，*技術的滿意，售后服務的滿意 ”為目標，確保每一位用戶都能獲得更的體驗。