實驗概念

將目的基因轉錄調(diào)控原件構建入帶有熒光素酶(Firefly luciferase)的表達載體，構建成報告基因質粒，使這段序列調(diào)控luciferase的轉錄表達。然后將報告基因質粒轉染細胞，給予其不同的處理后裂解細胞，并加入底物熒光素(luciferin)，luciferase可催化luciferin發(fā)出熒光(強波長在560nm左右)。檢測得到的熒光值高低可以判斷不同處理組對該轉錄調(diào)控原件的影響。為避免由于質粒轉染細胞時效率差異所造成的誤差，通常會轉入Renilla luciferase的報告基因質粒作為內(nèi)參(強波長在465nm左右)，即雙熒光報告系統(tǒng)。

實驗流程

（1） 用生物信息學方法分析并預測啟動子區(qū)可能的轉錄因子結合位點。

（2）設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質粒（pGL3-basic）中。

（3）篩選陽性克隆，測序。擴增克隆并提純質粒備用。

（4） 擴增轉錄因子質粒，提純備用。同時準備相應的空載質粒對照，提純備用。

（5） 培養(yǎng)293（或其它目的細胞），并接種于24孔板中，生長10-24小時（80%匯合度）。

（6） 將報告基因質粒與轉錄因子表達質粒共轉染細胞。

（7）提取蛋白并用于熒光素酶檢測。

（8） 加入底物，測定熒光素酶的活性。

（9） 計算相對熒光強度，并與空載對照比較。

注意事項：需提前告知相關的基因信息，如名稱、序列、ID等