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實(shí)驗(yàn)案例

現(xiàn)在的高通量測(cè)序平臺(tái)（主要是illumina）在直接測(cè)序時(shí)只能測(cè)出200bp長(zhǎng)度的序列，因此建庫(kù)方案是將DNA .片段化為200bp，然后深度測(cè)序后，后將序列拼接。我公司自主研發(fā)的非接觸聚能式超聲波DNA打斷儀可以在不接觸樣品的情況下隔著EP管將細(xì)胞DNA鏈至打斷至200bp或是更小。

 

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>：將收集的細(xì)胞DNA..片段化

樣品：鼠源乳腺癌細(xì)胞4T1

人源肝癌細(xì)胞HepG2

人源耐藥子宮肉瘤細(xì)胞MES-SA/DX5

 

實(shí)驗(yàn)步驟：

• 交聯(lián)： 取1皿細(xì)胞（10 cm平皿），10 mL培養(yǎng)基中加入270 uL  37%甲醛，使得甲醛的終濃度為1%，輕輕搖勻，37℃ 孵育10 min。
• 終止交聯(lián)：加甘氨酸至終濃度為0.125 M。550 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。輕輕搖勻，在室溫下放置5 min即可。
•  棄凈培養(yǎng)基，用冰冷的含1 mM  PMSF 的PBS清洗細(xì)胞2次，每次5-10mL。
•  加入3 ml冰冷的含1mM  PMSF的PBS，細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于離心管中，用PBS清洗培養(yǎng)皿兩次，收集到離心管中。
•  預(yù)冷后2000 rpm離心 5 min收集細(xì)胞。
•  新鮮配置一定體積的蛋白酶抑制劑復(fù)合物和SDS Lysis Buffer，充分混勻。
•  棄上清，加入一定體積含有蛋白酶抑制劑復(fù)合物的SDS Lysis Buffer，重懸細(xì)胞。
•  冰上放置10min。
•  開啟冷循環(huán)泵，并降溫至4℃以下。
•  開啟超聲波DNA打斷儀，將程序調(diào)制循環(huán)模式，超聲20s停10s。 
•  啟動(dòng)機(jī)器至超聲結(jié)束。
•  加解交聯(lián)試劑65℃ 解交聯(lián)4h以上，可過夜解交聯(lián)。
•  將超聲過的樣品提取DNA. 片段。
•  1.5%-2%瓊脂糖凝膠電泳15min。
•  拍照。

人源骨肉瘤細(xì)胞U2OS