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技術(shù)文章

脂氧合酶活性測(cè)定試劑盒使用說(shuō)明

閱讀:1119          發(fā)布時(shí)間:2024-8-19

注意:正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

規(guī)格:50 管/48 樣

產(chǎn)品內(nèi)容:

試劑一:液體×1 瓶,4℃保存。試劑二:液體×1 瓶,4℃保存。

試劑三:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前加入 5mL 試劑二,充分溶解。

產(chǎn)品說(shuō)明:

LOX 廣泛存在于植物組織中,催化不飽和脂肪酸氧化反應(yīng),導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化。在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、成熟衰老及逆境脅迫過(guò)程中具有重要作用。

LOX 催化亞油酸氧化,氧化產(chǎn)物在 234nm 處有特征吸收峰;測(cè)定 234nm 吸光度增加速率,來(lái)計(jì)算 LOX 活性。

自備儀器和用品:

研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

操作步驟:

一、粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。16000g,4℃離心 20min,取上清置冰上待測(cè)。

二、測(cè)定:

1.分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 234 nm,蒸餾水調(diào)零。

2.試劑二在 25℃水浴中預(yù)熱 30 min。

3.空白管:依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 蒸餾水、800μL 試劑二和 100μL 試劑三,迅速混勻后于 234nm 比色,記錄 15s 和 75s 的吸光值,分別記為 A1 和 A2。

4.測(cè)定管:依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 上清液、800μL 試劑二和 100μL 試劑三,迅速混勻后于 234nm 比色,記錄 15s 和 75s 的吸光值,分別記為 A3 和 A4。

注意:空白管只需測(cè)定一次。三、LOX 活性計(jì)算公式:

(1)按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化 0.001 個(gè)單位為 1 個(gè)酶活單位。

LOX (U/mg prot) = [(A4-A3)-(A2-A1)]×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T×1000

= 10000×[(A4-A3)-(A2-A1)]÷Cpr

(2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:25℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化 0.001 個(gè)單位為 1 個(gè)酶活單位。


LOX (U/g) = [(A4-A3)-(A2-A1)]×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T×1000

= 10000×[(A4-A3)-(A2-A1)]÷W

Cpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,需另外測(cè)定,建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒; V 樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,100μL=0.1mL;V 反總:反應(yīng)總體積,1mL;V 樣總:上清液總體積,1mL;W:樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間,1min。

注意事項(xiàng):

1.試劑三易自發(fā)氧化,從而導(dǎo)致空白管測(cè)定值偏高,必須臨用前配制,并且當(dāng)天使用完畢。

2.樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行,且須在當(dāng)日完成酶活性測(cè)定。



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