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做透Octet,發(fā)Nature!看看教科書級的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

閱讀:342        發(fā)布時(shí)間:2024-3-7

如何評價(jià)一篇好文章?創(chuàng)新性和可信性才是關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn),而非所用技術(shù)手段的復(fù)雜程度。近期,《Nature》發(fā)表的一篇文章,僅僅采用了兩種主要技術(shù)手段便一氣呵成。今天,就讓陳老師帶大家一探究竟。

人類免疫缺陷病毒(HIV)的感染是導(dǎo)致艾滋病的原因,HIV要實(shí)現(xiàn)復(fù)制和傳播,需要將遺傳物質(zhì)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)并整合進(jìn)染色體中。近日,馬克斯-普朗克研究所與麻省理工學(xué)院合作發(fā)表的一篇《Nature》文章[1],揭示了HIV是如何進(jìn)入核孔的。研究首先指向了核孔復(fù)合物(NPC),它由約30種不同的核孔蛋白(Nup)構(gòu)建而成,其中包括約10種所謂的FG-Nup,它們將形成屏障的苯丙氨酸-甘氨酸(FG)重復(fù)結(jié)構(gòu)域錨定到NPC支架上,呈凝膠狀,被稱為FG相(FG phase)。這種FG相填充在核孔中,通常只允許核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NTR)通過,然而研究發(fā)現(xiàn),HIV衣殼也可以滑過核孔的FG相

 

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圖1. NTR和HIV通過NPC示意圖

 

這篇發(fā)表在《Nature》雜志的文章所用的技術(shù)手段非常簡單,主要通過激光共聚焦對核膜與HIV進(jìn)行共定位,并利用Octet®非標(biāo)記分子互作分析系統(tǒng)檢測HIV衣殼蛋白CA和核孔蛋白(Nups)之間的分子相互作用。這兩種技術(shù)一表型功能,一內(nèi)在機(jī)制,二者相輔相成。特別是Octet®系統(tǒng)的分子互作數(shù)據(jù),占據(jù)了文章相當(dāng)?shù)钠?/p>

該文中關(guān)于Octet®分子互作的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案堪稱教科書級別,值得我們一同細(xì)細(xì)品味:

 

在Octet®實(shí)驗(yàn)方法中,研究者們將來自五種不同Nups(Nup98、62、58、50和358)的八個(gè)FG結(jié)構(gòu)域固定在鏈霉親和素傳感器上,將二硫鍵穩(wěn)定的CA六聚體作為分析物。

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圖2.Octet®實(shí)驗(yàn)方法示意圖

驗(yàn)證Octet®實(shí)驗(yàn)可行性之1

分析物陽參對照設(shè)置

 

importin β超家族的成員是最大的核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NTR) 類,允許NTR及其貨物復(fù)合物以非常高的分配系數(shù)進(jìn)入核膜,所以原則上NTR是與FG Nup結(jié)合的理想陽性對照。

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圖3. Octet®結(jié)果顯示:分析物importin β可以和含有FG結(jié)構(gòu)域的Nup結(jié)合,其親和力類似

驗(yàn)證Octet®實(shí)驗(yàn)可行性之2

固化物陽性對照和陰性對照設(shè)置

 

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,CA可以和Nup153和CPSF6結(jié)合,所以Nup153和CPSF6可以成為良好的固化物的陽性對照。當(dāng)然,與無關(guān)的固化物陰性對照Nesprin2沒有結(jié)合。

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圖4. 左圖:固化物Nup153與分析物CA六聚體的結(jié)合

中圖:固化物CPSF6與分析物CA六聚體的結(jié)合

右圖:固化物Nesprin2與分析物CA六聚體的結(jié)合

可行性確認(rèn)后,驗(yàn)證CA六聚體與不同Nups的結(jié)合強(qiáng)弱及狀態(tài)。

CA六聚體可以與富含F(xiàn)G結(jié)構(gòu)域的不同家族Nups快速動(dòng)態(tài)結(jié)合,并且與分析物陽性對照Nup153和CPSF6親和力相似,也與importin β親和力相似。因此,CA六聚體可以廣泛的與FG重復(fù)序列的Nups結(jié)合。

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圖5. CA六聚體與所有富含F(xiàn)G結(jié)構(gòu)域的Nups結(jié)合,并且結(jié)合速率較快

結(jié)合特異性驗(yàn)證(分析物陰性對照)

 

Octet®檢測發(fā)現(xiàn)FG結(jié)構(gòu)域的Nups與CA-N57A突變(該突變會(huì)阻礙與Nup153和CPSF6的FG基序的相互作用)的親和力減弱。

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圖6. 黑色虛線是突變體CA-N57A的親和力,與未突變相比,親和力大大降低。

基于生物層干涉技術(shù)的Octet®非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)是這篇《Nature》文章揭示分子機(jī)理的關(guān)鍵方法。一方面,因?yàn)樵诠袒锖头治鑫锷细鞣N對照讓結(jié)果更可信外,另一方面還因?yàn)镺ctet®系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn):

  • 非標(biāo)記Direct binding是趨勢,結(jié)果更準(zhǔn)確

  • 快速測定親和力,更加定量化地表征分子互作

  • 無洗滌步驟,可測弱親和力(解離快);本文的分子互作的解離都比較快,用傳統(tǒng)的pull-down技術(shù)可能會(huì)被洗掉,導(dǎo)致假陰性結(jié)果

  • 寫入了美國藥典,文章多,認(rèn)可度廣

  • 萬金油技術(shù),可以用與檢測DNA,小分子,蛋白質(zhì)等各種生物分子

  • 操作簡便,耗材及維護(hù)成本低

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只要把Octet®做透,發(fā)好文章不是難題!

 

 

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《生物層干涉技術(shù)應(yīng)用文集(第三版)》

《生物層干涉技術(shù)小分子應(yīng)用文集》

《生物層干涉技術(shù)病毒研究應(yīng)用文集》

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-參考文獻(xiàn)-

[1] HIV-1 capsids enter the FG phase of nuclear pores like a transport receptor.Nature,2024

 

 



 

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