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在生物制藥領(lǐng)域，抗體藥物的生產(chǎn)過程通常是一個(gè)復(fù)雜而多階段的流程，包括從細(xì)胞培養(yǎng)到最終分析的多個(gè)步驟。在這一過程中，不僅要選擇合適的細(xì)胞株以及優(yōu)化培養(yǎng)條件，最大限度抑制聚集體形成；同時(shí)由于糖鏈的不同導(dǎo)致抗體活性差異，還要進(jìn)行監(jiān)測(cè)及優(yōu)化，以確保最終產(chǎn)品的純度和生物活性。而這些流程往往需耗費(fèi)大量人力和時(shí)間。

除此之外，聚集體分析常采用尺寸排阻色譜法（SEC），在分析前需要對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化前處理，這進(jìn)一步增加了分析的復(fù)雜性?；趯?duì)質(zhì)量評(píng)估的嚴(yán)苛要求，研發(fā)一個(gè)能夠無縫對(duì)抗體進(jìn)行糖鏈及聚集體評(píng)估的自動(dòng)化分析系統(tǒng)顯得尤為必要。

針對(duì)這一挑戰(zhàn)，島津推出生物惰性超高效液相Nexera XS inert和液體處理器 LH-40的組合，為實(shí)現(xiàn)抗體藥物中糖鏈及聚集體分析的自動(dòng)化提供參考，詳情如下：

1預(yù)處理（粗純化）

樣品使用培養(yǎng)天數(shù)不同的抗體培養(yǎng)上清液（第4，7，12天），在粗純化之后進(jìn)行糖鏈分析及聚集體分析。

將第4，7，12天培養(yǎng)上清液分別取500μL，在下表?xiàng)l件下進(jìn)行純化。由于進(jìn)樣量相同，通過比較5.7min附近IgG抗體的峰面積值估計(jì)產(chǎn)量，結(jié)果顯示培養(yǎng)天數(shù)越多，IgG抗體的產(chǎn)量越高。

粗純化條件

粗純化后的各培養(yǎng)上清液色譜圖

2糖鏈分析

使用LH-40從第1步純化獲得的抗體餾分（上圖中的黃色框內(nèi)峰）中抽取40μL進(jìn)樣，并在下表的條件下進(jìn)行糖鏈分析。此次培養(yǎng)的抗體被認(rèn)為其抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC活性）越高，作為抗體藥物的效果也越好，高ADCC活性的糖鏈修飾狀態(tài)在峰3處洗脫。通過色譜圖對(duì)比可以看出，而隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，峰3的吸光度在下降，說明ADCC活性在下降。

糖鏈分析條件

各培養(yǎng)上清液中抗體糖鏈分析色譜圖

糖鏈分析的各峰面積%

3聚集體分析

使用LH-40從第1步純化獲得的抗體餾分中抽取20μL進(jìn)樣，按照下表?xiàng)l件進(jìn)行聚集體分析。結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，聚集體的比例增多。綜上所述，這表明在此培養(yǎng)條件下，第四天的回收是最優(yōu)的。

聚集體分析條件

不同培養(yǎng)天數(shù)的培養(yǎng)上清液中抗體聚集體分析色譜圖

不同培養(yǎng)天數(shù)的聚集體峰面積%

4結(jié)論

從Protein A純化的結(jié)果來看，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，抗體產(chǎn)生量會(huì)變多，但通過糖鏈及聚集體分析來看，高活性抗體的比例會(huì)減少，聚集體的比例也會(huì)增加，綜合來看，選擇在第四天中回收是最合適的。

上述分析過程中，采用生物惰性超高效液相Nexera XS inert有效解決抗體金屬吸附帶來的靈敏度和重復(fù)性問題，以及提高分析效率；液體處理器LH-40集成了自動(dòng)進(jìn)樣和餾分收集兩大功能，通過Nexera XS inert與LH-40的組合建立了全流程的自動(dòng)化，實(shí)現(xiàn)了從Protein A純化到抗體糖鏈分析及聚集體分析的完整分析系統(tǒng)。

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