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l                      類過敏反應(yīng)

類過敏反應(yīng)是中藥注射劑臨床應(yīng)用過敏反應(yīng)常見類型，是非經(jīng)典途徑的免疫反應(yīng)，其主要機制是細胞受到外界物質(zhì)刺激發(fā)生反應(yīng)后分泌組胺、蛋白酶和花生四烯酸等過敏性介質(zhì)。組胺則是過敏反應(yīng)中最主要的活性過敏介質(zhì)之一，可導(dǎo)致機體產(chǎn)生潮紅、頭痛、水腫、低血壓以及休克等癥狀。通過中藥注射劑對細胞培養(yǎng)液反應(yīng)，檢測組胺等過敏介質(zhì)的含量，對判斷中藥注射劑發(fā)生類過敏的風(fēng)險具有一定的應(yīng)用價值。 

l                      組胺檢測方法

由于生物樣品中組胺的含量低，量化組胺需要高靈敏度的分析方法。目前，組胺的檢測方法主要有 ELISA 檢測法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、氣相色譜和離子色譜法等。

l                      分析條件

液相條件

HILIC色譜柱(2.1 mm I.D.x150 mm L.3 um)

流動相：A 相 -20mM 乙酸銨 +0.1% 甲酸水溶液  B相-乙腈

流速：0.4 mL/min

柱溫：40℃

進樣量：5 μL

洗脫方式：等度洗脫，A:B=10:90(V/V)

質(zhì)譜條件

離子化模式：ESI,正離子模式

離子噴霧電壓：+4.5 kV

霧化氣流速：氮氣 3.0 L/min

干燥氣流速：氮氣 15 L/min

碰撞氣：氬氣

加熱模塊溫度：400℃

掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)

駐留時間：50 ms

延遲時間：3 ms

DL管溫度：250℃

MRM優(yōu)化參數(shù)

l                      樣品的處理

取培養(yǎng)一段時間后的細胞培養(yǎng)液，注射入中藥注射試劑刺激細胞后取細胞上清液，并在 0~4℃以3000 r/min 離心10 min，取上清液至進樣小瓶中，從中取 100 μL 至另一離心管中加入 20 μL內(nèi)標溶液，加入200 μL乙腈，充分挑勻室溫 15000 rpm,15 min 再次離心。取 100 μL 上清液加入 900 μL超純水充分振勻后直接上樣分析。

l                      分析結(jié)果

標樣的MRM色譜圖（10ng/mL）

線性關(guān)系

組胺校準曲線

重復(fù)性實驗

配制目標物濃度分別為 1、10、100 ng/mL 的混合標樣，平行測定各3次，考察儀器的重復(fù)性，保留時間和峰面積重復(fù)性結(jié)果如下表所示，儀器重復(fù)性良好。

回收率及精密度實驗

稱取組胺標準品，以陰性細胞上清液溶解，使其質(zhì)量濃度為1、10、100 ng/mL，按 前述“0~4℃以3000 r/min 離心10 min……取 100 μL 上清液加入 900 μL超純水充分振勻后直接上樣分析。”處理后，對樣品進行3個加標水平的回收率實驗，每個加標水平平行測定3次， 3 個加標水平的平均回收率為 90.4%~93.8%，相對標準偏差為 4.75%~5.78%。結(jié)果表明方法的回收率和精密度均較好。

LC-MS/MS測定中藥注射劑對細胞培養(yǎng)上清液組胺含量的分析方法，方法穩(wěn)定、特異性和靈敏度均較高，重復(fù)性好。因此，本方法可用于測定中藥注射劑對細胞培養(yǎng)上清液中組胺含量，對判斷中藥注射劑發(fā)生過敏的風(fēng)險具有一定的應(yīng)用價值。

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