乙酰膽堿酯酶（AchE）活性測(cè)定試劑盒操作步驟

                                                分光光度法50管/48樣

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

AchE屬于絲氨酸水解酶，廣泛存在于各種動(dòng)物組織和血清中。AchE催化乙酰膽堿（Ach）水解，在神經(jīng)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)中起重要作用。

測(cè)定原理：

AchE催化Ach水解生成膽堿，膽堿與二硫?qū)ο趸郊姿幔?/span>DTNB）作用生成5-巰基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm處有吸收峰，通過(guò)測(cè)定412 nm吸光度增加速率，計(jì)算AchE活性。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。

 乙酰膽堿酯酶（AchE）活性測(cè)定試劑盒操作步驟

試劑組成和配制：

提取液：液體×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入2.6mL試劑一，充分震蕩溶解。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入2.6mL試劑一，充分震蕩溶解。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，8000g 4℃離心10min，取上清液待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血清等液體：直接測(cè)定。

測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30min。

3. 取1mL玻璃比色皿，依次加入100μL上清液、800 μL試劑一、50μL試劑二和50 μL試劑三，迅速混勻，于412nm處測(cè)定3min內(nèi)吸光值變化，第10s吸光值記為A1，第190s吸光值記為A2。△A測(cè)定管=A2-A1。

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AchE活性計(jì)算公式：

1. 組織AchE活性

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個(gè)酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷（Cpr ×V樣）÷T

= 245×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個(gè)酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/g鮮重)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷（W ×V樣÷V樣總）÷T

= 245×△A÷W

2. 細(xì)菌、細(xì)胞AchE活性

活性單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個(gè)酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/10⁴ cell)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T

= 245×△A÷細(xì)胞數(shù)量

3. 血清AchE活性

活性單位定義：每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個(gè)酶活單位。

AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷V樣÷T

=245×△A

ε：TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×10³ L/mol/cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），1 mL=0.001 L；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）；W：樣本質(zhì)量，g；V樣：加入上清液體積（mL），0.1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），3 min。

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