實驗干貨—ELISA實驗顯性淡、靈敏度低是為什么?怎么解決?

　　Elisa 實驗以靈敏度較高、特異性較好的特點在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，但操作中的各個環(huán)節(jié)對試驗的檢測效果影響較大，如不注意，有可能導(dǎo)致顯色不全、花板等結(jié)果。

　　酶聯(lián)免疫吸附實驗

　　一、顯色淡，靈敏度偏低

　　可能原因及解決方法：

　　試劑盒從2~8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平試劑盒未充分平衡衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫(約25℃)樣品一般選擇培養(yǎng)上清、血清、血漿。其他樣品

　　2、樣品不適合做ELISA檢測形式可能不適合做ELISA檢測或者需要優(yōu)化檢測的條件(例如稀釋液的成分)

　　3、酶標板在貯存或洗后拍干時過分防止板過于干燥，干燥

　　4、包被抗體遭到破壞 操作溫和，移液槍不能碰到孔底

　　5、樣本和抗體孵育條件不合適，按照說明書條件，建議孵育過程中全程振蕩孵育

　　6、洗滌浸泡時間過長，按照說明書操作，勿人為增加漫泡時間

　　7、偶聯(lián)HRP試劑污染棄去試劑，重新配置

　　8、錯誤的稀釋偶聯(lián)HRP試劑棄去試劑，重新配置確定合適的孵育時間:人為判定-最高濃度的標準TMB底物孵育時間過短，因非人。

　　9、品出現(xiàn)深藍色;S4-5有淡藍色;機器判定620n為因素影響，需要優(yōu)化孵育時間m波長下測定OD值達到0.6-0.65

　　10、樣本濃度過高或存在基質(zhì)效應(yīng)建議做不同稀釋倍數(shù)，確認樣本最佳稀釋倍數(shù)酶標儀濾光片設(shè)置有問題或者波

　　11、確認儀器設(shè)置及選擇正確的波長檢測長選擇不對不能使用細胞培養(yǎng)板，建議使用ELISA專用高吸

　　12、酶標板不適合做ELISA附力板子

　　二、出現(xiàn)白板，陽性對照不顯色

　　可能原因及解決方法：

　　1、顯色液變質(zhì)更換新的顯色液

　　2、洗滌液配制有誤請按說明書所示稀釋倍數(shù)配制

　　3、未加酶結(jié)合物而認為已加入注意不要漏加

　　4、終止液誤作洗滌液稀釋或當?shù)孜镆菏褂妹看渭右呵熬鶓?yīng)看清標簽請按照說明書所示配置說明書，注意

　　5、標準品稀釋方法錯誤/或標準品有問題單位和稀釋倍數(shù)，建議使用同批次試劑盒，不能混用不

　　6、不同試劑盒或不同批號的試劑混用，同試劑盒或不同批號的試劑

　　三、不正常的標準曲線

　　可能原因及解決方法：

　　1、錯誤的方法重懸標準品加入正確量的溶液重懸標準品，重懸充分

　　2、標準品稀釋錯誤按照說明書要求稀釋標準品

　　3、標準品污染用一次性的滅菌吸頭，標準品貯存于2-8℃

　　4、錯誤的倍比稀釋步驟按照說明書倍比稀釋標準品TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，

　　5、波長選擇錯誤而前者比色波長為450nm，后者為492nm。雙波長比色分析優(yōu)于單波長

　　6、標準品混用不同批號試劑勿混用

　　7、試劑盒在運輸途中時間太盡量縮短運輸時間，夏季應(yīng)放冰塊降溫長，溫度太高，標準品失ELISA未終止而直接檢測4顯色需終止后檢測，否則會出現(xiàn)620nm比450nm讀

　　8、50nm和620nm數(shù)高的現(xiàn)象。

　　四、OD值超出正常范圍

　　可能原因及解決方法：

　　1、錯誤的樣品或標準品的稀釋按照說明書稀釋

　　2、偶聯(lián)抗體濃度過高按照說明書調(diào)整到最佳的濃度

　　3、TMB底物孵育時間過長調(diào)整到合適的孵育時間

　　4、樣品或標準品污染避免污染

　　5、錯誤的孵育時間或溫度按照說明書

　　6、孵育時未加蓋導(dǎo)致溶液揮發(fā)和污染 貼封片或加蓋

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