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免疫組化實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)精密的技術(shù)操作，需要嚴(yán)格把控各個(gè)環(huán)節(jié)以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。以下是免疫組化實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵注意事項(xiàng)：
一、血清封閉
血清封閉的目的是為了一抗與組織的非特異性結(jié)合，造成假陽性，一般會(huì)采用BSA、羊血清等封閉這些位點(diǎn)，封閉血清一般是和二抗同一來源的，室溫封閉10-30min。
二、一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間
不同的一抗?jié)舛?，孵育時(shí)間和溫度等對(duì)染色結(jié)果往往有較大的影響。在4℃下，反應(yīng)緩慢，背景較淺；而37℃反應(yīng)較快，時(shí)間較短；室溫介于兩者之間，二抗一般室溫孵育30min。
三、DAB顯色
檢測(cè)背景的深淺和特異性染色的深淺基本上都以DAB孵育條件決定。DAB的顯色時(shí)間并不是固定的，主要方法是使用顯微鏡控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)且出現(xiàn)背景著色較淺時(shí)就可以沖洗。如果DAB顯色時(shí)間過長(zhǎng)（超過十分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，可能是一抗體濃度過低或者封閉時(shí)間過長(zhǎng)，也可以加入金屬離子來增強(qiáng)顯色（如硫酸銅、氯化鈷、硫酸鎳銨等）；如果DAB顯色時(shí)間過短顏色就很深，這可能是一抗過高，需要下調(diào)抗體濃度，如果短時(shí)間內(nèi)過深
四、復(fù)染
免疫組化染色后為了襯托出組織形態(tài)結(jié)構(gòu)有必要進(jìn)行復(fù)染，常用試劑為Mayer’s蘇木染色，一般為2 min左右，DAB在核蛋白著色的時(shí)間可以適當(dāng)縮短，最后用氨水或PH 8.0的TBS返藍(lán)。
五、封片
在封片階段我們通常是用中性樹膠來進(jìn)行，封片過程中注意斜靠蓋玻片防止氣泡的產(chǎn)生從而對(duì)結(jié)果進(jìn)行營影響，建議最好在通風(fēng)櫥操作，這樣有利于氣泡排除干凈，不影響后續(xù)的鏡檢。
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