ELISA酶聯(lián)免疫吸附測定檢測方法及實驗步驟-賽默飛

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附檢測）是什么檢測方法？

ELISA是一種平板檢測技術，旨在檢測和定量肽、蛋白質、抗體和激素等物質。其他名稱，比如酶免疫測定（EIA）也用于描述該的技術。在 ELISA 中，抗原必須固定化到固體表面，然后與連接到酶的抗體混合。通過與適當?shù)牡孜锓跤?，測量報告基因酶的活性來產(chǎn)生可測量的產(chǎn)物，從而實現(xiàn)檢測。該檢測策略中的最關鍵元素是高度特異性的抗體-抗原相互作用。

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本頁內容

l ELISA 方法（直接、夾心等）

l 直接與間接檢測 ELISA

l 競爭性 ELISA 和其他方法 (競爭性 ELISPOT 等)

l 整套即用型 ELISA 試劑盒

l 選擇和包被 ELISA 孔板

l 預包被 ELISA 孔板

l ELISA 的一抗

l 封閉緩沖液和洗滌緩沖液

l ELISA 檢測方式

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）檢測方法介紹

酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 是一種檢測和定量復雜混合物中特定蛋白質的強大方法。該方法最初由 Engsorvall 和 Perlmann (1971) 描述，可使用特異性抗體分析固定在微孔板孔中的蛋白樣品。ELISA 通常在96孔（或384孔）聚苯乙烯孔板中執(zhí)行，它們可與抗體和蛋白質被動結合。試劑的這種結合和固定化使 ELISA 容易設計和執(zhí)行。讓 ELISA 的反應物固定化到微孔板表面，使其容易在檢測過程中把結合與未結合材料分開。具備洗掉非特異性結合材料的能力，使 ELISA 成為粗品制備中測量特異性分析物的強大工具。

盡管 ELISA 的許多變體已經(jīng)在不同的情況下開發(fā)和使用，但它們都依賴于相同的基本元件：

1. 包被 / 捕獲—直接或間接將抗原固定在聚苯乙烯微孔板孔表面。

2. 板封閉—添加不相關蛋白質或其他分子，以覆蓋微孔板孔中所有不飽和表面結合位點。

3. 檢測 / 檢測—用與抗原結合的抗原特異性抗體進行培養(yǎng)。

4. 信號測量—檢測特異性抗體上直接或二次標記產(chǎn)生的信號。

酶標記是辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）。其他酶也已使用；這些酶包括 β - 半乳糖苷酶，乙酰膽堿酯酶和過氧化氫酶。使用 HRP 或 AP 偶聯(lián)物執(zhí)行 ELISA 時提供廣泛的底物選擇。底物選擇取決于所需的檢測靈敏度和可用于信號檢測的儀器（光吸收酶標儀、熒光酶標儀或發(fā)光酶標儀）。

ELISA 檢測方法—直接，間接和夾心 ELISA

ELISA 使用有多種方法。這些分為直接，間接或夾心法捕獲和檢測方法。關鍵步驟是固定目標抗原，通過直接吸附到檢測板或通過已附著在檢測板上的捕獲抗體間接完成。然后可以直接（標記一抗）或間接（標記二抗）檢測抗原。使用的 ELISA 檢測形式是夾心式 ELISA 檢測，可間接固定和間接檢測是否存在靶抗原。這種類型的捕獲檢測稱為“夾心”檢測，因為待測分析物結合在兩種一抗之間，每種一抗檢測抗原的不同表位——捕獲抗體和檢測抗體。由于其靈敏度和特異性，夾心 ELISA 方法被高度使用。

圖1.常見 ELISA 形式（直接與夾心檢測）的圖表。在檢測中，通過直接吸附到檢測板或首先將捕獲抗體連接到檢測板表面來固定目標抗原。然后可以使用酶偶聯(lián)一抗（直接檢測）或者匹配的一組未標記一抗和偶聯(lián)二抗（檢測檢測）執(zhí)行抗原檢測。

直接與間接 ELISA 檢測

在上面討論和說明的標準檢測方法中，捕獲和檢測的差異是值得關注的，采用專門用于檢測步驟的特定策略非常重要。與在孔板上捕獲抗體所采用的方法無關（通過直接吸附到表面，或者通過預包被“捕獲”抗體，與在夾心法 ELISA 中相同），檢測步驟（直接或間接檢測）很大程度上決定了 ELISA 的靈敏度。

直接檢測方法使用經(jīng)報告酶標記的一抗或帶有與抗原直接反應的標記的一抗。執(zhí)行直接檢測時可以使用直接固定化到檢測板上的抗原或者采用捕獲檢測形式。雖然直接檢測在 ELISA 中未廣泛使用，但是在組織和細胞的免疫組織化學染色中卻很常見。

間接檢測方法使用標記的二抗或生物素-鏈霉親和素復合物進行擴增，是 ELISA 形式。二抗對一抗具有特異性。在夾心法 ELISA 中，關鍵是二抗僅對檢測一抗（而不是捕獲抗體）具有特異性，或者該檢測對抗原不具有特異性。通常，通過使用來自不同宿主的捕獲抗體和一抗（例如分裂來自小鼠 IgG 和兔 IgG）可實現(xiàn)這一目的。對于夾心法檢測，使用已經(jīng)交叉吸附的二抗有利于清除任何可能對捕獲抗體有親和力的二抗。

直接，間接和夾心 ELISA 檢測方法的比較

直接ELISA檢測方法優(yōu)勢：

1. 速度快，因為只有一種抗體，且所用步驟更少。

2. 消除了二抗的交叉反應。

直接ELISA檢測方法缺點：

1. 使用酶或標簽進行標記可能會對一抗的免疫反應性造成不利影響。

2. 為每個特異性 ELISA 系統(tǒng)標記一抗既耗時且成本高昂。

3. 市售偶聯(lián)一抗的數(shù)量有限。

4. 從一個實驗到另一個實驗，不能靈活選擇一抗標記。

5. 極低限度的信號放大。

間接ELISA檢測方法優(yōu)勢：

1. 有多種商用標記二抗可用。

2. 功能多樣，因為很多一抗在一個物種內就能完成，相同的標記二抗可用于檢測。

3. 保留一抗的免疫反應性，因其未標記。

4. 靈敏度提高，因為每個一抗包含多個抗原決定簇，可以通過標記二抗進行結合，實現(xiàn)信號放大。

5. 不同的檢測方法可搭配相同的一抗 (比色法，化學發(fā)光法等) 使用。

間接ELISA檢測方法缺點：

1. 可能與二抗發(fā)生交叉反應，產(chǎn)生非特異性信號。

2. 在該程序中需要額外的孵育步驟。

夾心ELISA檢測方法優(yōu)勢：

1. 對靶抗原具有高靈敏度和高特異性，因為兩種抗體用于捕獲和檢測。

2. 相同的捕獲抗體可以使用不同的檢測方法。

間接ELISA檢測方法缺點：

需要更多優(yōu)化來鑒定抗體對，并確保捕獲和檢測抗體之間的交叉反應性有限。

競爭性 ELISA 和其他方法

除了上述的標準直接和夾心法形式，還存在其他幾種 ELISA 形式：

競爭性 ELISA 是在抗原較小或只有一個抗原決定簇或抗體結合位點時使用的一種策略。該方法的一個變化在于它包含標記純化抗原而非抗體。來自樣品的未標記抗原和標記抗原為了與捕獲抗體相結合而競爭。與單獨使用標記抗原的檢測孔進行比較，來自純化抗原的信號減少表示樣品中存在抗原。

競爭性 ELISA 方法概述

在競爭性 ELISA 中，也稱為抑制 ELISA ，通過信號干擾檢測來測定靶抗原的濃度。樣品中的靶抗原可與標記的參比或標準品競爭，以便與固定在板上的有抗體結合。

ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點檢測）指的是對接種到由 PVDF 膜提供支持的微孔板微孔中的細胞所分泌的蛋白質進行類似于 ELISA 的捕獲和測量。它屬于“夾心法”檢測，其中，蛋白質是在局部被捕獲的，因其是平板接種細胞分泌的，并且檢測是使用沉淀底物進行的。ELISPOT 與蛋白質印跡法類似，其結果是膜表面的斑點。

細胞內 ELISA 使用在標準微孔板內通宵平板接種并培養(yǎng)的細胞來執(zhí)行。培養(yǎng)細胞被固定、透性化和封閉后，使用抗體檢測靶蛋白。這是直接檢測，不屬于夾心法檢測。二抗為熒光（適合使用熒光板讀數(shù)儀或顯微鏡進行直接測量）或酶偶聯(lián)（適合平板讀數(shù)儀使用可溶性底物進行檢測）抗體。

ELISA 幾乎總是使用96孔或384孔聚苯乙烯平板和溶液（即生物體液、培養(yǎng)基或細胞裂解液）中的樣品來執(zhí)行。本文章剩余部分將討論該平臺。

ELISA 板

為特異性抗原開發(fā) ELISA 時，第一步是為抗原或捕獲抗體優(yōu)化平板包被條件。首先選擇檢測微孔板（不是經(jīng)過組織培養(yǎng)處理的平板），蛋白結合力為400 ng/cm2。同樣重要的是，蛋白質結合的 CV 值（變異系數(shù)）應較低（ <5%），以便本應相同的微孔和平板間檢測結果中的數(shù)值的偏差有限。平板顏色的選擇取決于要檢測的信號。透明聚苯乙烯平底反應板用于比色信號，而黑色或白色不透明反應板用于熒光和化學發(fā)光信號。使用前目測檢查反應板塑料是否有瑕疵或劃損，否則從開發(fā)的檢測采集數(shù)據(jù)時會引起畸變。Thermo Scientific 未包被 ELISA 反應板提供多種表面，以使用您的大分子優(yōu)化包被。這些反應板旨在得出最佳結果，實現(xiàn)批次間的可靠性和各孔之間的可重復性。

通過將蛋白質被動吸附到檢測微孔板的塑料上，實現(xiàn)平板包被。該過程是通過塑料和非極性蛋白質殘基之間的疏水作用來完成的。盡管個別蛋白質需要特定條件或預處理來優(yōu)化結合，包被平板最常見的方法包含添加 2-10 μg/ml 蛋白質溶于堿性緩沖液（比如磷酸鹽緩沖鹽水（pH 值 7.4）或碳酸鹽-重碳酸鹽緩沖液（pH 值 9.4））后的溶液。讓平板在 4-37° C 條件下培養(yǎng)數(shù)小時至通宵。通常，在清除包被溶液后，添加封閉緩沖液以確保覆蓋塑料孔所有剩余可用的結合表面（參見后續(xù)討論）。包被平板可以立即使用，或者干燥后儲存在 4° C 條件下供以后使用，視包被蛋白質的穩(wěn)定性而定。

請務必注意，最佳包被條件和平板結合力因每種蛋白質而異，必須通過實驗確定。除了競爭 ELISA 以外，包被平板的捕獲蛋白數(shù)量超過檢測過程中實際可結合數(shù)量，是為了促進檢測實現(xiàn)可能最大的工作范圍。一些蛋白質，尤其是抗體，在平板上實現(xiàn)最佳包被時的濃度低于其最大結合力，是為了防止非特異性蛋白在隨后的步驟中出現(xiàn)稱為“鉤狀效應”的現(xiàn)象。蛋白質被困在包被蛋白之間產(chǎn)生鉤狀效應，妨礙了有效清洗和清除未結合的蛋白。當鉤狀物非特異性捕獲一抗和二抗的檢測時，會產(chǎn)生高背景信號，從而降低檢測的信噪比和靈敏度。

預包被 ELISA 孔板

對于抗體和蛋白質，通過被動吸附來包被平板通常效果良好。但是被動吸附也可能引起問題，包括定位不當、變性、固定化效率低下以及污染物和靶分子結合不良。多種類型的預包被板可幫助緩解這些問題。預包被 蛋白 A ， G 或 A/G 的板有助于正確捕獲抗體并保持抗原結合能力。使用谷胱甘肽、金屬螯合物或捕獲蛋白包被的平板可以將融合蛋白沿正確方向連接到微孔板上。 肽和其他小分子，通常通過被動吸附無法有效結合，可以進行生物素化并高效連接到鏈霉抗生物素蛋白或 NeutrAvidin 蛋白包被平板上。生物素化抗體還可以固定到預包被生物素結合蛋白的平板上。以這種方式使用預包被平板，可以從平板表面物理分離抗原或捕獲抗體，作為應對其變性作用的保護措施。聚合物涂層和經(jīng)修飾的表面可用于幫助增加被動吸附。高性能表面包被平板（預包被和預封閉）提供96孔和384孔形式（黑色、透明或白色）的廣泛選擇。這些包被的微孔板可用于 ELISA 開發(fā)和其他基于微孔板的檢測，使用光吸收、熒光或化學發(fā)光酶標儀進行檢測。

ELISA 用不同類型的微孔板

圖2. ELISA 用不同類型的微孔板

以下示例舉例說明了聚合物包被的變化如何影響蛋白質結合力。

圖3.改性表面上的 IgG 結合。引入官能團將影響塑料聚合物的結合特性。本實驗表明表面改性將影響蛋白質的結合。各種蛋白質在未處理對照、Thermo Scientific Nunc MultiSorp（非常親水表面）和 MaxiSorp（親水表面）平底板上的吸附比較表明表面選擇對分析優(yōu)化的重要性。各種分子的表現(xiàn)截然不同，取決于表面的特性。例如，在堿性條件下，IgG 將吸附到 MaxiSorp 改性聚苯乙烯上，與未經(jīng)處理的對照平板相比，其容量顯著更大。如果是 MultiSorp，表面上的官能團限制了蛋白質吸附 IgG；結合力與未經(jīng)處理的平板相比，可明顯看出這一點。

ELISA 的一抗

單克隆或多克隆抗體可用作夾心 ELISA 和其他 ELISA 系統(tǒng)中的捕獲和檢測抗體。單克隆抗體對單個抗原決定簇具有固有的單特異性，可對抗原內的細微差異進行精細檢測和定量。多克隆抗體通常用作捕獲抗體，用于沉降盡可能多的抗原。然后單克隆抗體用作夾心法檢測中的檢測抗體，用于改善特異性。除了使用傳統(tǒng)單克隆抗體，重組單克隆抗體也可以用于 ELISA。例如，Invitrogen 兔重組抗體來自于產(chǎn)生抗體的細胞系，該細胞系采用工程技術后可表達特異性抗體重鏈和輕鏈 DNA 序列。與源自雜交瘤的傳統(tǒng)單克隆抗體相比，重組抗體不易發(fā)生細胞系漂移或批次間變化，因此可實現(xiàn)峰值抗原特異性。

設計夾心法 ELISA 的一個重要考慮因素是捕獲抗體和檢測抗體必須識別兩種不同的不重疊的抗原決定簇?？乖c捕獲抗體相結合時，不得掩蓋或改變檢測抗體識別的抗原決定簇。彼此互不干擾且可同時結合的捕獲抗體和檢測抗體被稱之為“匹配對”，且適用于開發(fā)夾心法 ELISA。很多一抗供應商提供關于抗原決定簇的信息，并指出已在 ELISA 中經(jīng)過校驗可作為匹配對的抗體對。使用相同的抗體進行捕獲和檢測會限制最終 ELISA 的動態(tài)范圍和靈敏度。

ELISA封閉緩沖液和洗滌緩沖液

微孔板孔的結合力通常高于每個孔中包被的蛋白質數(shù)量。剩余表面積必須封閉，防止抗體或其他蛋白質在后續(xù)步驟中吸附到平板上。封閉緩沖液是由無關蛋白質、蛋白質混合物或被動吸附到平板所有剩余結合表面的其他化合物組成的溶液。如果通過減少背景信號并提高信噪比可改善檢測靈敏度，則封閉緩沖液有效。理想的封閉緩沖液將結合到發(fā)生非特異性相互作用的所有可能位點，消除背景，而未改變或掩蓋抗原決定簇進行抗體結合。

開發(fā)任何新的 ELISA 時，請務必在檢測中針對最高信噪比測試幾種不同的封閉劑。很多因素會影響非特異性結合，包括有關樣品和抗體的各種蛋白質間相互作用。選擇封閉劑時的最重要參數(shù)是信噪比，它是使用包含目標分析物的樣品獲得的信號與使用不含目標分析物的樣品獲得的信號進行比較后得出的測量結果。使用數(shù)量不足的封閉劑將導致背景過度和信噪比下降。使用過高濃度的封閉劑可能掩蓋抗體-抗原相互作用或者抑制酶作用，再次引起信噪比下降。不存在適合每種情況的封閉劑，實證檢驗對于實現(xiàn)封閉步驟的真正優(yōu)化至關重要。

除了封閉之外，重要的是在 ELISA 每個步驟之間執(zhí)行清洗。清洗不充分可能造成高背景，同時，過度清洗可能因從孔微孔中洗脫抗體和/或抗原導致靈敏度下降。清洗在生理緩沖液中執(zhí)行，比如不含任何添加劑的 Tris-緩沖生理鹽水（TBS）或磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）。通常，在緩沖液中加入洗滌劑，比如 0.05% 的吐溫20，有助于移除非特異性結合的材料。另一種常見的技術是使用封閉緩沖液的稀釋溶液并加入一些洗滌劑。清洗緩沖液含有封閉劑并加入洗滌劑有助于將檢測中的背景降。為了獲得最佳結果，請使用高純度洗滌劑，防止引入雜質，以免干擾檢測此類酶抑制劑或過氧化物。

ELISA 實驗檢測方法

圖4. ELISA 檢測方式

ELISA實驗檢測步驟是所有 ELISA 系統(tǒng)中的最終階段。除非使用放射或熒光標記，該步驟包含引入酶底物。酶將底物轉化為可檢測的產(chǎn)物。如果 ELISA 已妥善構建和開發(fā)，則添加底物時產(chǎn)生的信號強度與平板中捕獲并與檢測試劑結合的抗原數(shù)量成正比。酶偶聯(lián)抗體（尤其是包含辣根過氧化物酶（HRP）的抗體）為 ELISA 提供了最大的檢測靈活性和成像方法），因為可用于顯色、化學熒光和化學發(fā)光成像的底物豐富多樣。

比色底物形成一種可溶性有色產(chǎn)物，隨著時間的推移，該產(chǎn)物會與每個孔中存在的酶量成比例。當達到所需的顏色強度時，可以直接測量產(chǎn)品吸光度，也可以在某些情況下添加終止液，以提供固定的終點檢測。比色底物可用于辣根過氧化物酶 (TMB ， OPD ， ABTS) 和堿性磷酸酶 (PNPP)。盡管不像熒光或化學發(fā)光底物那么靈敏，ELISA 顯色底物也可實現(xiàn)直接顯像并執(zhí)行動力學研究。另外，使用標準吸光度板讀數(shù)儀檢測 ELISA 顯色底物也是很多實驗室的常見做法。

圖5. HRP 不同 TMB 比色 ELISA 底物靈敏度的比較。TMB（3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）是 HRP 的常見顯色底物，氧化后產(chǎn)生藍色。然后，加入硫酸或磷酸（常用用于終止反應的溶液）后，顏色變?yōu)辄S色。在左圖中，比較了多種 TMB 底物在 ELISA 板測定中的性能。

化學發(fā)光是一種化學反應，會產(chǎn)生光釋放的能量。大多數(shù)化學發(fā)光底物依賴 HRP ，但某些 AP 同等產(chǎn)品可供選擇。方法是在存在 HRP 和過氧化物緩沖液的情況下使用魯米諾。魯米諾被氧化，形成了一種激發(fā)狀態(tài)的產(chǎn)品，隨著光線衰減到地面狀態(tài)而發(fā)出光線。只有酶底物反應時才會發(fā)生光發(fā)射，因此當?shù)孜镒優(yōu)楹谋M時，信號停止?；瘜W發(fā)光檢測通常比比比色檢測更靈敏。將化學發(fā)光底物用于 ELISA 的一個缺點是信號強度比其他底物變化大。對于需要讀取很多平板的檢測，如果在平板讀數(shù)之前信號開始衰減，就會出現(xiàn)問題。為此，請務必確保檢測已使用該底物進行優(yōu)化，避免將樣品內的信號衰落誤判為低抗原豐度。HRP 的化學發(fā)光底物包括 Thermo Scientific SuperSignal ELISA Pico 和 ELISA Femto 底物。

熒光 ELISA 底物不那么常用，并且需要熒光計產(chǎn)生正確激發(fā)光束，以引起熒光標記生成信號發(fā)射?；瘜W熒光檢測也是基于酶的，但生成的產(chǎn)品是熒光而非比色的。使用具有適當激發(fā)和發(fā)射濾光片的熒光計測量信號。在動力學分析中可以隨時間測量化學熒光反應，也可以使用終止液直接測量。HRP 的化學熒光底物示例包括 Thermo Scientific QuantaRed 和 QuantaBlu 底物。

整套即用型 ELISA KIT試劑盒

除了本文章剩余部分討論的個別組分和 ELISA 一般原則，即用型夾心法 ELISA 試劑盒在商業(yè)上已可用于檢測作為共同研究目標的數(shù)百鐘特異性細胞因子、神經(jīng)生物學分析物和磷酸化蛋白質。

為很多靶標提供兩種試劑盒類型：

ELISA 試劑盒包含預包被抗體反應板、檢測抗體、緩沖液、稀釋液、標準品和底物。除了傳統(tǒng)的 ELISA 試劑盒之外，還可提供即時 ELISA 試劑盒板，其中包含所有必要成分，包括捕獲抗體和凍干檢測抗體，鏈霉親和素 -HRP 和樣品稀釋劑。此外，可單獨提供包含標準曲線標準品的聯(lián)排孔，以便使用 96 孔進行檢測樣品。

圖6.一步法 ELISA 技術與傳統(tǒng) ELISA 程序的比較。與傳統(tǒng) ELISA 試劑盒相比，生產(chǎn)的 Thermo Scientific Invitrogen 一步法 ELISA 試劑盒包含開發(fā) ELISA 所需的捕獲抗體和凍干檢測抗體及其他試劑。

· 未包被 ELISA 試劑盒—這些試劑盒配有包被自己平板所需的所有試劑，以及除終止液和洗滌緩沖液外運行檢測。

· 抗體對試劑盒—這些試劑盒含有經(jīng)過優(yōu)化的匹配抗體，適合夾心 ELISA 開發(fā)和標準品 (無板或檢測試劑)。

本 ELISA 方法選擇指南比較了 Thermo Fisher Invitrogen 抗體對試劑盒與 ELISA 試劑盒的特性。

圖7. Thermo Fisher Invitrogen 抗體對試劑盒與 ELISA 試劑盒的特性

*每項檢測都有其具體參數(shù)。請根據(jù)您具體的免疫分析/試劑盒查閱實驗方案。

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