TNF腫瘤壞死因子信號通路及功能作用介紹-賽默飛

TNF（腫瘤壞死因子）是什么？

細(xì)胞因子中的腫瘤壞死因子（TNF）超家族是一類多功能促炎細(xì)胞因子，可激活與細(xì)胞存活、凋亡、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞分化相關(guān)的信號通路。通過兩種受體 TNFR1（TNF 受體-1 或 CD120a）和 TNFR2（TNF 受體-2 或 CD120b）誘導(dǎo)對腫瘤壞死因子的細(xì)胞應(yīng)答。TNFR1 在大多數(shù)人體組織中通過與 TNF α 結(jié)合而被激活。TNFR2 在免疫細(xì)胞中表達(dá)，并可被 TNFα 和 TNFβ 激活 [1]。Thermo Scientific™ 具有多種產(chǎn)品可幫助進(jìn)行 TNF 研究。

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關(guān)鍵 TNF 通路靶點(diǎn)

TNF 與許多信號通路靶標(biāo)相互作用，包括：

作為對炎癥和感染的應(yīng)答，促炎細(xì)胞因子 TNFα 由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生。TNFα 最初通過與細(xì)胞表面受體 TNFR1（p55）和 TNFR2（p75）結(jié)合而引發(fā)促炎信號。TNFR1 和 TNFR2 通過三種不同信號通路引發(fā)細(xì)胞對 TNFα的應(yīng)答，導(dǎo)致 caspases 激活以及 AP-1 和 NFκB 轉(zhuǎn)錄因子的激活 [2]。激活 TNFα 導(dǎo)致 TNFR1 受體發(fā)生三聚化以及位于 TNFR1 蛋白胞質(zhì)區(qū)的死亡結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。

死亡結(jié)構(gòu)域的聚集引起 TRADD（TNFR 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域）銜接蛋白的募集。其他 TRADD 介導(dǎo)的 FADD（Fas 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域）、RAIDD（具有死亡結(jié)構(gòu)域的 RIP 相關(guān) ICH-1/CED-3 同源蛋白）、MADD（MAPK 激活死亡結(jié)構(gòu)域）和 RIP（受體相互作用蛋白）的募集誘發(fā)激活 caspase 8。Caspase 8 介導(dǎo)一系列受調(diào)節(jié)的蛋白切割事件，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

caspase 8 對 BID（BH3 相互作用死亡結(jié)構(gòu)域）切割產(chǎn)生 tBID（截短型 BID），導(dǎo)致線粒體膜破壞和細(xì)胞色素 C（CytoC）的釋放。CytoC 與 APAF1（凋亡蛋白酶激活因子-1）結(jié)合使得 caspase 9 被募集，caspase 9 切割 caspase 3 產(chǎn)生其活性形式。XIAP（X-linked inhibitor of apoptosis，X 連鎖凋亡抑制蛋白）可抑制該信號通路中此階段 caspase 的激活。

TRAF2（TNF 受體相關(guān)因子-2）與 TRADD 的結(jié)合介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子 AP-1 和 NFκB 通過 TNF 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活，從而與 MADD 和 RIP 形成激活的復(fù)合物。該復(fù)合物與 NIK（NF-κB-誘導(dǎo)激酶）結(jié)合后可磷酸化 IκK，此時(shí)，NFκB 易位至細(xì)胞核，引發(fā) IκB 降解 [3]。TNFR1、TRADD、TRAF2、MADD、RIP 復(fù)合物（Jun NH2-末端激酶）可激活 MAPK，由此可激活 AP-1 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。AP-1 是許多應(yīng)激和生長相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄激活所必需 [4]。

TNF信號通路數(shù)據(jù)

Thermo Scientific™ 為 TNF 信號通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)提供抗體、ELISA、Luminex 多重檢測和生長因子。

以下是使用 Thermo Scientific™ 產(chǎn)品的 ELISA 和流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)。

用濃度為10 μg/mL 的抗牛 TNF-α 多克隆抗體（產(chǎn)品編號 PBOTNFAI）以100 µL/孔進(jìn)行包被，并在 4℃ 下孵育過夜，進(jìn)行 TNF-α 的 ELISA 分析。使用在 PBST 中稀釋的3%牛血清白蛋白（BSA）封閉孔板1小時(shí)。用200 µL/孔 PBST 洗滌孔板6次，然后在室溫下以100 µL/孔重組牛 TNF-α 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和組織培養(yǎng)上清液中的重組綿羊 TNF-α（均以未知濃度開始的按照 Log2 稀釋的稀釋液）孵育1小時(shí)。用洗滌緩沖液將孔板洗滌6次，并在室溫下用濃度為1 µg/mL 的抗牛 TNF-α 生物素偶聯(lián)多克隆抗體（產(chǎn)品編號 PBOTNFABI）以100 µL/孔孵育1小時(shí)。用洗滌緩沖液將孔板洗滌6次，然后使用2 µg/mL 的 HRP-偶聯(lián)鏈霉素親和素在室溫下擴(kuò)增信號1小時(shí)。以100 µL/孔使用3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）檢測10分鐘。用 0.2M 硫酸終止反應(yīng)。在分光光度計(jì)上于450 nm 處讀取吸光度（光密度 [OD] 值）。

C57BL/6 脾細(xì)胞未進(jìn)行刺激，或者在存在布雷非德菌素 A 的情況下，使用佛波醇肉豆蔻酸酯（PMA）和離子霉素對 C57BL/6 脾細(xì)胞刺激5小時(shí)。然后用抗小鼠 CD4 FITC（產(chǎn)品編號 MCD0401）對細(xì)胞進(jìn)行表面染色，隨后使用 FIX & PERM 細(xì)胞透化試劑盒（產(chǎn)品編號 GAS003 或 GAS004）進(jìn)行固定和透化，并用抗小鼠干擾素 γ（IFN-γ）PE-Cy7 偶聯(lián)物（產(chǎn)品編號 A18713）和抗小鼠腫瘤壞死因子（TNF-α）PPacific Blue™ 偶聯(lián)物（產(chǎn)品編號 RM90128）進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。使用 Attune 聲波聚焦流式細(xì)胞儀（藍(lán)色/紫色）采集樣品，采用488 nm 激發(fā)和530/30 nm 帶通發(fā)射濾光片檢測 FITC，采用640 nm 長通濾光片檢測 PE-Cy7 偶聯(lián)物。使用405 nm 激發(fā)和450/40 nm 帶通發(fā)射濾光片檢測 Pacific Blue™ 熒光。圖 A：在存在布雷非德菌素 A 的情況下，未進(jìn)行刺激（左圖）或用 PMA 和離子霉素刺激（右圖）的總小鼠脾細(xì)胞的 IFN-γ 和 TNF-α 共染色。圖 B：用上述條件刺激后 CD4 T 細(xì)胞表達(dá) TNF-α（左圖）和 IFN-γ（右圖）。

TNF信號通路有何功能？

TNF 信號傳導(dǎo)通路在各種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞凋亡和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)以及炎癥誘導(dǎo)。TNF (腫瘤壞死因子) 是一種多功能促炎細(xì)胞因子，可對脂質(zhì)代謝、凝血、胰島素抵抗和內(nèi)皮功能產(chǎn)生影響。自從 20 年前被發(fā)現(xiàn)以來，TNF 就一直被認(rèn)為是一種抗癌劑。TNFR (TNF 受體) 超家族的成員可向細(xì)胞發(fā)出存活和死亡信號。

TNF 通過兩種受體 TNFR1 (TNF 受體-1) 和 TNFR2 (TNF 受體-2) 發(fā)揮作用。TNFR1 由所有人類組織表達(dá)，是 TNF α 的主要信號傳導(dǎo)受體。TNFR2 大多在免疫細(xì)胞中表達(dá)，并介導(dǎo)有限的生物反應(yīng)。TNFR2 可結(jié)合 TNF α 和 TNF β (1,4)。

TNF α 通路

TNF α 是一種促炎細(xì)胞因子，由多種細(xì)胞類型產(chǎn)生，包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞，應(yīng)對炎癥、感染和其他環(huán)境壓力。TNF α 可一系列不同的生物學(xué)效應(yīng)，因細(xì)胞類型誘導(dǎo)而異。TNF α 通過在細(xì)胞表面與其受體 TNFR1 (p55) 和 TNFR2 (p75) 結(jié)合來起作用。大多數(shù)細(xì)胞都表達(dá) TNFR1 ，后者被認(rèn)為是 TNF α 細(xì)胞毒性的主要介體 (3 ， 5)。TNF α 與其兩種受體 TNFR1 和 TNFR2 結(jié)合，導(dǎo)致信號傳導(dǎo)子募集，至少活化三種不同的效應(yīng)子。通過復(fù)雜的信號級聯(lián)和網(wǎng)絡(luò)，這些效應(yīng)子會激活半胱天冬酶以及兩種轉(zhuǎn)錄因子：活化蛋白-1 和 NF-κB (核因子-KappaB)。最初，TRADD (TNFR 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域) 蛋白與 TNFR1 結(jié)合。然后， TRADD 募集 FADD (Fas 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域、RAIDD (RIP 相關(guān) ICH-1/CED-3-同源蛋白伴有死亡結(jié)構(gòu)域)、madd (MAPK 活化死亡結(jié)構(gòu)域) 和 RIP (受體相互作用蛋白)。TRADD 和 FDD 與 TNFR1 結(jié)合可導(dǎo)致半胱天冬酶 8 的募集、低聚和激活?；罨陌腚滋於?8 隨后啟動蛋白水解級聯(lián)，包括其他半胱天冬酶 (半胱天冬酶 3, 6 和 7)，并最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。半胱天冬酶 8 也裂解 BH3 (相互作用死亡結(jié)構(gòu)域)。tBID (截短型) 可破壞外線粒體膜，導(dǎo)致促凋亡因子細(xì)胞 C (細(xì)胞色素-C) 的釋放。從膜間空間釋放的細(xì)胞因子 C 與 APAF1 (凋亡蛋白酶激活因子-1) 結(jié)合，后者可募集半胱天冬酶 9，而蛋白則可水解激活半胱天冬酶 3。新型 61-kDa 蛋白激酶 RIP2 與 RIP 有關(guān)，后者是 TNFR1 的組分，介導(dǎo)半胱天冬酶死亡蛋白酶的募集。RIP2 過表達(dá)同時(shí)發(fā)出 NF-KappaB 活化和細(xì)胞死亡的信號 (3, 5-9)。

利用 TNF RAF-2 活化信號傳導(dǎo)通路

TRAF2 (TNF 受體相關(guān)因子-2) 參與兩條不同的通路的激活，這些通路可通過 JNK (JUN NH2-末端激酶)、MEKK (MEK 激酶)、p38 以及 RIP 一起導(dǎo)致激活蛋白-1 的激活、， 還通過 NIK (NF- κ B 誘導(dǎo)激酶)激活 NF-κB 活化。已證明 TNF α 可激活 MAPK (促分裂原活化蛋白激酶)：ERK1 和 ERK2 (細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶)。過表達(dá) SODD (死亡域沉默子) (一種與 TNFRI DD 相關(guān)的 60 kDa 蛋白)，可抑制 TNF 誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和 NF-κB 活化，證明其作為這些信號傳導(dǎo)通路的陰性調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮作用。

TNF β 與 TNFR2 的相互作用

TNFR2 是 TNF β 的受體。TNF β 由活化的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，且可能對許多腫瘤和其他細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。在中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和破骨細(xì)胞中，TNF β 可導(dǎo)致活化，而在許多其他細(xì)胞類型中，它還可導(dǎo)致 MHC 和粘附分子的表達(dá)增加。

TNF信號通路傳導(dǎo)的影響

TNF 信號通路與多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病以及 TRAPS (TNF 受體相關(guān)定期綜合征)等相關(guān)。對 TNF 及其相關(guān)物的更好地了解，最終應(yīng)該導(dǎo)致開發(fā)出小分子，后者可成功抑制和調(diào)節(jié)這些細(xì)胞因子的生物活性，從而為治療干預(yù)提供新的途徑。

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參考文獻(xiàn)

1. Kawasaki H. et al.(2002) Identification of genes that function in the TNFα-mediated apoptotic pathway using randomized hybrid ribozyme libraries.Nat Biotechnol 20: 376-80.

2. Kagoya, Y. et al.(2014) Positive feedback between NF-κB and TNF-α promotes leukemia-initiating cell capacity.J Clin Invest 124(2): 528-542.

3. Baud V. et al.(2001) Signal transduction by tumor necrosis factor and its relatives.Trends Cell Biol 11: 372-7.

4. Kai-Li He. et al.(2002) A20 Inhibits Tumor necrosis factor (TNF) α-Induced apoptosis by disrupting recruitment of TRADD and RIP to the TNF receptor 1 complex in jurkat T cells.Mol Cell Biol 22: 6034-6045.

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