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BCA法測(cè)蛋白濃度是通過(guò)比色檢測(cè)進(jìn)行總蛋白質(zhì)定量的常用方法。相比基于考馬斯染料的定量方法（Bradford 法定量）,Pierce BCA 蛋白定量試劑具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兛梢约嫒莺卸噙_(dá) 5％ 表面活性劑（去垢劑）的蛋白樣品，并且受蛋白組成差異的影響小得多，從而具有更高的蛋白間均一性。

賽默飛最新推出的內(nèi)含免稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的 BCA 蛋白定量試劑盒最多可將實(shí)驗(yàn)時(shí)間縮短80%。免稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品是一組與排槍兼容的預(yù)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，使您可以輕松地將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品一步轉(zhuǎn)移到微孔板中。

賽默飛提供BCA蛋白定量和Lowry蛋白定量產(chǎn)品，請(qǐng)?jiān)L問(wèn)獲取產(chǎn)品最新信息。根據(jù)您的蛋白樣品選擇合適的BCA蛋白定量試劑盒。

BCA 蛋白定量試劑盒概述

· 免稀釋Rapid Gold BCA 快速蛋白定量試劑盒——綠色至黃色（A480 nm），雙組分的精確定量試劑，兼容去垢劑，僅需室溫下孵育5分鐘，即可測(cè)定總蛋白與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。

· BCA 蛋白定量試劑盒（內(nèi)含免稀釋標(biāo)準(zhǔn)品）——綠色至紫色（A562 nm），雙組分的精確定量試劑，兼容去垢劑，37°C下孵育30分鐘以檢測(cè)總蛋白質(zhì)濃度與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。

· 還原劑兼容型 BCA 蛋白定量試劑——經(jīng)典 BCA 試劑盒的還原劑兼容型版本 ，用于測(cè)量含有 DTT 或 BME 硫醇還原劑的樣品的蛋白濃度。

· 微量 BCA 蛋白定量試劑——三組分 BCA 試劑盒，專(zhuān)門(mén)用于測(cè)量稀釋蛋白溶液（0.5 至 20 μg/mL）中的總蛋白濃度。

輕松、快速、準(zhǔn)確

熱門(mén)BCA 蛋白定量試劑盒現(xiàn)自帶免稀釋 BSA 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品——7個(gè)濃度的預(yù)稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)品，專(zhuān)為排槍設(shè)計(jì)。

Pierce 免稀釋蛋白定量產(chǎn)品可大幅減少傳統(tǒng)定量實(shí)驗(yàn)中繁瑣的稀釋操作，并使用來(lái)自美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院 (NIST) 的純化 BSA進(jìn)行校準(zhǔn)，以確保標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。

BCA法測(cè)蛋白濃度法原理

BCA 蛋白定量的化學(xué)反應(yīng)

Pierce BCA 蛋白定量試劑通過(guò)在堿性環(huán)境中用蛋白質(zhì)將 Cu2+ 還原為 Cu+（廣為人知的雙縮脲反應(yīng)），然后通過(guò)二辛可寧酸（BCA）對(duì)亞銅陽(yáng)離子（Cu+）進(jìn)行高靈敏度和高選擇性的比色檢測(cè)。

圖 1.第一步：將銅與堿性環(huán)境中的蛋白質(zhì)螯合，形成藍(lán)色復(fù)合物。在此反應(yīng)中，含有三個(gè)或三個(gè)以上氨基酸殘基的肽與含酒石酸鈉鉀的堿性環(huán)境中的二價(jià)銅離子形成有色螯合物。

單個(gè)氨基酸和二肽在雙縮脲反應(yīng)中不受影響，但三肽以及更大的多肽或蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生吸收峰位于 540 nm 的淡藍(lán)色至籃紫色復(fù)合物。一個(gè)二價(jià)銅離子與附近四到六個(gè)多肽結(jié)合形成有色螯合物。產(chǎn)生的顏色強(qiáng)度與參與反應(yīng)的肽鍵數(shù)目成正比。

圖 2.第二步：BCA 試劑是一種高靈敏度、高選擇性的比色檢測(cè)試劑，與第一步形成的亞銅陽(yáng)離子（Cu+）反應(yīng)，產(chǎn)生紫色。

BCA– 銅復(fù)合物是水溶性的，在 562 nm 處具有強(qiáng)線性吸收，吸收度隨蛋白濃度增加而升高。在 550 至 570 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)，可對(duì)紫色進(jìn)行測(cè)量，此范圍內(nèi)信號(hào)丟失最?。ㄉ儆?/span>10 %）。BCA 試劑產(chǎn)生的信號(hào)約比使用雙縮脲試劑產(chǎn)生的信號(hào)靈敏100 倍（檢測(cè)下限更低）。

Pierce 免稀釋Rapid Gold BCA 蛋白定量試劑采用與經(jīng)典 BCA 定量試劑相同的銅離子還原法，并含有銅螯合劑。在顯色反應(yīng)的第二步中，Pierce 免稀釋Rapid Gold BCA 螯合劑與第一步還原產(chǎn)生的亞銅陽(yáng)離子（Cu+）反應(yīng)，產(chǎn)生一種深金色反應(yīng)產(chǎn)物。此銅復(fù)合物隨著蛋白濃度的增加，在 480 nm 波長(zhǎng)處表現(xiàn)出強(qiáng)烈的線性吸光度。

免稀釋 BCA 蛋白定量

免稀釋 BSA 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品可單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)，部分熱門(mén)BCA蛋白定量試劑盒里面已內(nèi)含免稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。與 Bradford法或 Pierce BCA Protein Assay 試劑盒相比，免稀釋Rapid Gold BCA 蛋白定量試劑盒無(wú)需稀釋樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，從而可將實(shí)驗(yàn)時(shí)間減少高達(dá) 80%。 此外，它只需要 5 分鐘的室溫孵育。 經(jīng)典BCA試劑盒也有內(nèi)含免稀釋 BSA 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的版本—— Pierce 免稀釋BCA Protein Assay 試劑盒。

圖 3. 與其他蛋白質(zhì)檢測(cè)相比，Pierce 免稀釋Rapid Gold BCA蛋白定量試劑盒最高可將實(shí)驗(yàn)時(shí)間縮短 80%。 按照說(shuō)明書(shū)中的方案在微孔板中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 樣品共10個(gè)：5個(gè)細(xì)胞裂解物樣品、5個(gè)純化蛋白樣品。BCA 和 Bradford 法的標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過(guò)連續(xù)稀釋 2 mg/mL 牛血清白蛋白 (BSA) 標(biāo)準(zhǔn)品生成的。Pierce 免稀釋Rapid Gold BCA 蛋白定量試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線是使用內(nèi)含的兼容排槍的Pierce 免稀釋 BSA 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品生成的。十個(gè)樣品中的四個(gè)預(yù)計(jì)起始濃度 > 2 mg/mL，因此BCA 和 Bradford 法需要進(jìn)行樣品稀釋?zhuān)庀♂?/span>Rapid Gold BCA 試劑盒不需要稀釋樣品。然后將樣品與各個(gè)試劑盒的工作試劑混合并按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行孵育。

BCA法測(cè)蛋白濃度的優(yōu)點(diǎn)

BCA法蛋白定量

BCA 法定量的主要優(yōu)點(diǎn)之一是它可產(chǎn)生一條線性響應(yīng)曲線。此響應(yīng)曲線有助于準(zhǔn)確測(cè)定未知蛋白的濃度，并具有比其他常規(guī)定量方法更寬的動(dòng)態(tài)范圍。

圖 4. Pierce 免稀釋Rapid Gold BCA 蛋白定量試劑盒可在寬動(dòng)態(tài)范圍 (0–10 mg/mL) 內(nèi)生成線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。 使用溶于0.9% 生理鹽水中的純化 BSA (0–10 mg/mL) 為 Pierce 免稀釋Rapid Gold BCA 蛋白定量試劑盒和Quick Start Bradford 蛋白定量試劑盒 (Bio-Rad) 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 兩種方法均按照說(shuō)明書(shū)中的方案在微孔板中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 使用 Thermo Scientific Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀讀取吸光度數(shù)據(jù)。

BCA法測(cè)蛋白濃度的準(zhǔn)確度

BCA 法蛋白定量的另一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是蛋白間差異較低。蛋白的組成和結(jié)構(gòu)具有高多樣性，在一些檢測(cè)中，蛋白在氨基酸序列、等電點(diǎn)（ pI ）、二級(jí)結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈或輔基上的差異會(huì)導(dǎo)致比色響應(yīng)的差異。由于蛋白間差異較低，BCA 蛋白定量方法能夠更準(zhǔn)確地測(cè)定未知樣品的蛋白濃度。

圖 5. Pierce 免稀釋Rapid Gold BCA 蛋白定量試劑盒和Quick Start Bradford 蛋白定量試劑盒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與樣品的已知濃度對(duì)比。兩種方法均按照說(shuō)明書(shū)中的方案在微孔板中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于 Bradford 法，將 5 μL 樣品添加到 250 μL Bradford 工作試劑中，并在室溫下孵育 5 分鐘。 對(duì)于免稀釋Rapid Gold BCA 法，將10 μL 樣品添加到200 μL 免稀釋Rapid Gold BCA 工作試劑中，并在室溫下孵育5 分鐘。 蛋白樣品的已知濃度信息來(lái)自廠家，并通過(guò) 280 nm 處的吸光度進(jìn)行確認(rèn)。

BCA 蛋白定量實(shí)驗(yàn)方案

使用免稀釋 BSA 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行 BCA 蛋白定量

Pierce BCA 蛋白定量試劑產(chǎn)生線性響應(yīng)曲線（R2 > 0.95），可根據(jù)檢測(cè)未知樣品蛋白濃度所需的動(dòng)態(tài)范圍，選用兩種不同的方案進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn) Pierce BCA 蛋白定量試劑使用雙組分系統(tǒng)檢測(cè) 20 至 2000 μg/mL 的蛋白質(zhì)濃度：試劑 A 是含有 BCA 試劑的碳酸鹽緩沖液，試劑 B 是一種硫酸銅溶液，兩者結(jié)合制成一種蘋(píng)果綠色的工作溶液，在蛋白存在的情況下，30 分鐘后在 37℃ 下變成紫色。由于顏色反應(yīng)不是真正的終點(diǎn)反應(yīng)，Pierce BCA 蛋白定量具有相當(dāng)大的實(shí)驗(yàn)方案靈活性?？梢酝ㄟ^(guò)增加孵育溫度提高檢測(cè)的靈敏度。使用增強(qiáng)型試管方案（即在 60°C 下孵育 30 分鐘）時(shí)，檢測(cè)工作范圍變化為 5–250 μg/mL，可實(shí)現(xiàn)稀釋蛋白樣品的準(zhǔn)確定量。

圖 6. BCA 蛋白定量試劑盒（內(nèi)含免稀釋標(biāo)準(zhǔn)品）搭配排槍進(jìn)行蛋白定量實(shí)驗(yàn)。

Rapid Gold BCA 蛋白定量試劑盒的實(shí)驗(yàn)方案

該比色測(cè)定法延續(xù)了 BCA 定量的高靈敏度和線性度，極大縮短孵育時(shí)間，可以更快地進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn) BCA 定量操作。該方法可在室溫下于 5 分鐘內(nèi)完成孵育，無(wú)需長(zhǎng)時(shí)間等待或者將樣品置于高溫下。

圖 7. 免稀釋 Rapid Gold BCA 蛋白定量試劑盒實(shí)驗(yàn)方案。

BCA法測(cè)蛋白濃度常見(jiàn)問(wèn)題：

Q. 哪些物質(zhì)會(huì)干擾BCA定量分析的結(jié)果？

A. 部分干擾 BCA 定量分析的物質(zhì)包括還原性物質(zhì)、螯合劑以及強(qiáng)酸或強(qiáng)堿，即使?jié)舛群艿鸵部赡軙?huì)影響定量的結(jié)果。

另外。一些物質(zhì)對(duì) BCA 定量分析方法的干擾程度較低，當(dāng)其在原始樣本中含量低于某特定濃度時(shí)，僅對(duì)結(jié)果造成微小影響（可耐受）。此外，多種干擾物質(zhì)可能產(chǎn)生加和作用，例如當(dāng)樣本緩沖液中含有多種干擾物質(zhì)時(shí)，即使其中單一干擾物質(zhì)的濃度低于可兼容濃度，總體仍有可能對(duì)蛋白質(zhì)的定量分析產(chǎn)生干擾。

Q. BCA法與Bradford法應(yīng)如何選擇？

A. 主要由樣本中的干擾物質(zhì)決定。如果你的蛋白抽提試劑中含有大量去垢劑且不含有螯合劑、還原劑時(shí)，可使用BCA法；如果你的蛋白里含有EDTA等金屬螯合劑或者含有還原型物質(zhì)，且不含有去垢劑時(shí)，可使用Bradford法。

Q. 蛋白抽提完是否可以直接蛋白定量？

A. 依據(jù)測(cè)試過(guò)的數(shù)據(jù)，Thermo Scientific M-PER， RIPA總蛋白抽提試劑，Mem-PER Plus膜蛋白抽提試劑，NE-PER核蛋白抽提試劑，亞細(xì)胞組分分離試劑盒等均可直接使用BCA進(jìn)行蛋白定量，T-PER抽提后 的蛋白經(jīng)過(guò)稀釋可使用BCA進(jìn)行定量。  

Q. BCA法能檢測(cè)多肽濃度嗎？

A. 不能，檢測(cè)多肽濃度需要用專(zhuān)門(mén)的多肽濃度檢測(cè)試劑盒，如Pierce™ Quantitative Fluorometric Peptide Assay（貨號(hào)23290），或Pierce™ Quantitative Colorimetric Peptide Assay（貨號(hào)23275）。

Q. BCA法需要孵育至少30分鐘，有沒(méi)有更快的方法？

A. 全新Pierce 快速Gold BCA試劑盒（貨號(hào)A53225， A53226），只需孵育5分鐘，室溫下即可進(jìn)行。此外，Gold BCA試劑盒保留了經(jīng)典BCA法的高線性、高去垢劑兼容性和低蛋白差異性，使用更加快捷、簡(jiǎn)便。

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